产品简介

Firefly&NLuc Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以D-荧光素钾盐为底物来检测Firefly荧光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该萤光反应的同时，以新型底物HFFZ检测NLuc荧光素酶报告基因的活性。该试剂盒具有灵敏度高、稳定性好的特点，可在单个样品中同时检测Firefly荧光素酶和NLuc荧光素酶的活性，适用于双报告基因检测。

产品组分

保存条件

干冰运输；-20 ℃保存，6 个月有效；-80 ℃保存，一年有效。萤火虫荧光素酶检测试剂和NLuc荧光素酶底物（50×）建议 -80 ℃避光保存。

使用说明

1.裂解细胞：将细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。

1) 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

冰上孵育5-10 min ，充分裂解细胞。

注：如果荧光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。

2) 充分裂解后，10,000-15,000×g离心3-5分钟，取上清用于测定。（选做）

注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。裂解产物可在4 ℃保存12 h，-20 ℃/-80 ℃可长期存放。
2.试剂准备：

1) 融解Firefly荧光素酶检测试剂和NLuc荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。NLuc荧光素酶检测底物(50×)置于冰浴或冰盒上备用。

注：萤火虫荧光素酶检测试剂建议分装使用，尽量避免反复冻融。

2) 按照每个样品需100 μL检测液的量，取适量NLuc荧光素酶检测缓冲液，按照1:50加入NLuc荧光素酶检测底物(50×)配制成NLuc荧光素酶检测工作液。

例如，980 μLNLuc荧光素酶检测缓冲液中加入20 μLNLuc荧光素酶检测底物(50×)充分混匀后即可配制成约1 mL NLuc荧光素酶检测试剂。

注：NLuc荧光素酶检测工作液建议现配现用，工作液配制后经冻融再次使用可能会影响测试结果。

3.加样检测：

1) 取20 μL裂解液加至待检测的96孔板中，按照实验需求，可设置3-5个重复孔。

2) 加入100 μL萤火虫荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力，检测尽量在1小时内完成。

3) 加入100 μL NLuc荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测NLuc荧光素酶的活力，检测尽量在1小时内完成。

7.分析数据：

①实验设计：根据不同实验目的，在每个培养板中都应设置对照组、实验组和空白对照组。为了保证实验准确性，理论上每个实验组（包括对照组）都应当减去空白对照组的萤火虫和NLuc荧光素酶的发光测量值。

a.空白对照组：

背景F：未转染细胞+Firefly荧光素酶检测试剂。

背景R：未转染细胞+Firefly荧光素酶检测试剂+NLuc荧光素酶检测试剂。

注：空白对照组的样品量必须与实验样品量相同，包含与实验样品相同的培养基/血清组合，并加上完全相同的检测试剂。

b.实验组：转染细胞经实验化合物处理(即实验组F和实验组R)。

c.对照组：转染细胞不经处理，用以标准化结果(即对照组F和对照组R)。

②计算结果：

实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)。

对照组比值=(对照组F-背景F）/(对照组R-背景R)。

表达倍数=实验组比值/对照组比值。

注意事项

1.反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将所有试剂平衡至室温（20-25 ℃）再使用，可将裂解液、检测试剂、检测缓冲液在室温或不超过25ºC的水浴中融解并混匀后使用；

2.检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。对于同一样品的检测，不同仪器的数值不可横向比较；

3.测定时间：样品和测定试剂混合后即可进行测定，测定时间通常为1-10秒区间内，增加检测时长会同时增加样本和本底的荧光读值，根据实验情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品宜使用相同的测定时间；

4.检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号；

5.通常加入NLuc荧光素酶检测缓冲液后对上一步Firefly荧光素酶的抑制可达到99%以上，但可能残留微量活性，因此在转染时需将NLuc荧光素酶的表达量控制在其RLU读值与萤火虫荧光素酶相当或略高的水平。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套；

7.本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内!