试剂产品

n 产品简介：

      该系列荧光染料是 TSA 技术的显色试剂，可在组织或细胞的预期位置着色，染色结果可体现出所染靶标的表达模式和丰度。本产品为10T/100T的100X 染料母液，使用时按照合适比例进行稀释，按照说明书推荐使用可用10次/100次染色。

酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的 DAB 显色方法,TSA 技术同样采用 HRP 标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法或者抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物，重复下一种一抗-HRP二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。）

TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应（酪胺盐在 HRP 催化H₂O₂下形成共价键结合位点），产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题,大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说如果用 TSA 技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。

n 保存条件：

冰袋（wet ice）运输；4 ℃避光干燥保存，一年内使用有效。

n 使用方法：

1.     染色前去除玻片上的 TBST buffer；

2.     配置染料工作液，取1 μL的100X染料母液，使用信号放大液按1:100稀释为1X的工作液，信号放大稀释液需自备（为1×TBST含0.003 % H2O2：1×TBST100 mL，加入100 μL 3 % H2O2，混匀即可，该稀释液容易失效，建议现配现用）；

注：本产品的建议稀释比1:100，实验者也可根据实验结果调整稀释比例（建议稀释比例范围1:50 - 1:500）；

3.     用移液器在玻片上滴加染料工作液100 μL，浸没组织区域。

4.     室温保湿震荡孵育10 min。

5.     使用1X的TBST bufer 浸洗玻片，室温浸片 3 min，重复三次。

6.     微波修复（微波中火8 min停火8 min转中低火7 min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片），室温自然冷却。

7.     灭菌水洗片1次，1X的TBST buffer 浸片2 min。

8.     单染结束，封片观察或追加后续染色。

9.     如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育高丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育低丰度目的蛋白对应的抗体。

n 注意事项：

1．本品要避光保存，室温融化后，使用离心机进行短暂离心，干净吸头吹吸混匀后取用；

2．为了您的自身安全，实验前请做好有效防护；

3．本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内！