产品规格

产品简介

Firefly&Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以D-荧光素钾盐为底物来检测萤火虫萤光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该萤光反应的同时，以腔肠素-h 为底物检测海肾萤光素酶报告基因的活性。该试剂盒具有灵敏度高的特点，可在单个样品中同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性，适用于双报告基因检测。

产品组分

保存条件

干冰运输；-20℃保存，12 个月有效。

海肾荧光素酶底物（100×）建议分装 -80℃保存。

使用说明

1.裂解细胞：将细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
a.对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

冰上孵育5-10 min ，充分裂解细胞。

注：如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
b.充分裂解后，10,000-15,000×g 离心3-5分钟，取上清用于测定。（选做）
注：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。裂解产物可在4℃保存12 h，-20℃/-80℃可长期存放。（裂解产物反复冻融5次无影响）。
2.融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰浴或冰盒上备用。
3.按照每个样品需100微升检测液的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如，1毫升海肾萤光素酶检测缓冲液中加入10微升海肾萤光素酶检测底物(100×)充分混匀后即可配制成约1毫升海肾萤光素酶检测试剂。

4.取20 μL裂解液加至待检测的96孔板中，按照实验需求，可设置3-5个重复孔。

5.加入100 μL萤火虫萤光素酶检测试剂，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。

6.加入100 μL海肾荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测海肾荧光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
7.分析数据：

①实验设计：根据不同实验目的，在每个培养板中都应设置对照组、实验组和空白对照组。为了保证实验准确性，理论上每个实验组（包括对照组）都应当减去空白对照组的萤火虫和海肾萤光素酶的发光测量值。

a.空白对照组：

背景F：未转染细胞+萤火虫萤光素酶检测试剂。

背景R：未转染细胞+萤火虫萤光素酶检测试剂+海肾萤光素酶检测试剂。

注：空白对照组的样品量必须与实验样品量相同，包含与实验样品相同的培养基/血清组合，并加上完全相同的检测试剂。
b.实验组：转染细胞经实验化合物处理(即实验组F和实验组R)。
c.对照组：转染细胞不经处理，用以标准化结果(即对照组F和对照组R)。

②计算结果：

实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)。

对照组比值=(对照组F-背景F）/(对照组R-背景R)。

表达倍数=实验组比值/对照组比值。

注意事项

1.反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将所有试剂平衡至室温（20-25℃）再使用；

2.检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同；

3.检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号；

4.D组分海肾萤光素酶底物易挥发，注意密封保存；

5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。

6.本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

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